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EMI:检测血清特异抗体可以显著提高新冠病毒感染的确诊率

来源:国际肝病 日期:2020-02-24 17:07;作者:临床肝胆病杂志    

  本周刚在国际期刊Emerging Microbes & Infections (EMI) (中文译名《新发微生物与感染》) 发表的一篇发自武汉临床前线的报告发现,新冠病毒在身体多部位采集到样本后,虽然可以用分子生物学检测到病毒存在,但这些部位的检出阳性率都不高。这个实验里的病人都没有从支气管下部采集标本,而这次新冠病毒的主要感染位置是下呼吸道。这个报道解释了前一段临床检测病毒感染阴性阳性不定的困惑。同时这篇报道发现在发病后第5天,100%的病人都可以在血清里查到针对病毒的抗体反应。根据这一发现,及时进行血清特异抗体检测应该是能大大提高临床病毒感染诊断的有效手段。
 
  摘要
 
  2019年11月,一种新型冠状病毒(2019-nCoV)在中国武汉爆发,并迅速蔓延至世界各地。2019-nCoV最初被认为通过呼吸道传播并导致肺炎,因此以口腔拭子为基础的分子学诊断被用于确认是否感染。同样,两次口腔拭子检测阴性的患者即可出院。然而,许多冠状病毒也可感染肠道并通过粪-口途径传播,此次2019-nCoV是否入侵被感染者的其他器官仍有待检测。笔者在武汉当地一所医院对感染此病毒的患者进行研究,发现肛门拭子和血液中也存在2019-nCoV,且在感染后期肛门拭子阳性率高于口腔拭子阳性率,这说明病毒可通过粪-口途径传播。笔者还发现血清学检查可以提高检测的阳性率,应当在未来的流行病调查中使用。本文旨在提出警示:2019-nCoV可能通过多种途径散播。
 
  引言
 
  冠状病毒(Coronaviruses, CoVs)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)中的正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。2003年,一种人类冠状病毒(SARS-CoV)导致严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome, SARS)的爆发。最近,一种SARS相关CoV被认为是导致中国中部城市武汉疫情爆发的病原体。据估计,该疫情于2019年12月12日开始,截至2020年2月3日,中国的实验室确诊病例为17332例,累计死亡361例[1]。该病毒已经通过来自武汉的旅客传播到其他23个国家[1]。典型的症状为发热、乏力、气促,严重的情况下出现肺炎[2-4]。这种疾病最初被称为“不明原因病毒性肺炎”。
 
  笔者很快确定了病原体,并将它命名为2019-nCoV(世界卫生组织指定的病毒名称)。新发现的病毒是SARS相关病毒(SARSr-CoV),但其与SARS-CoV的基因组同源性仅为74.5%[2]。笔者开发了基于病毒刺突基因的分子检测工具。笔者此前的研究表明,qPCR方法可用于口腔拭子或支气管肺泡灌洗液中2019-nCoV的检测[5]。此外,笔者利用另一种SARSr-CoV Rp3来源的交叉反应核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)开发了IgM和IgG检测方法[6],该蛋白与2019-nCoV的NP具有92%的同源性。使用这些血清学工具,笔者证明感染2019-nCoV患者的病毒抗体滴度增加[5]。
 
  临床观察显示,与SARS-CoV相似,2019-nCoV通过呼吸道引起肺炎。因此,口腔拭子中病毒抗原的存在可被用作2019-nCoV的检测标准。同样,以24小时为间隔的两次口腔拭子阴性被正式视为病毒清除。本文对武汉市某医院的2019-nCoV进行了调查,旨在探讨该病毒可能存在的其他传播途径。
 
  材料与方法
 
  样本采集
 
  口腔拭子、肛门拭子和血液样本在所有患者知情同意并由新发传染病定点医院伦理委员会批准后,在武汉市肺科医院采集。共进行了两次研究。在第一次研究中,笔者收集了39例患者的样本,其中7例病情严重。在第二次研究中,笔者收集了139名患者的样本,但没有他们的临床记录。笔者只展示病毒核苷酸检测阳性的患者。除有特殊标注外,患者选择均无性别或年龄偏倚。对于拭子,每管加入1.5 ml DMEM+2% FBS培养基。2500rpm涡旋60s静置15 - 30分钟后收集上清液。将拭子上清加入裂解缓冲液以提取RNA。收集的血清在24h内3000 g离心15 min, 然后56℃30 min灭活,最后4℃保存直到使用。
 
  RNA提取和实时定量PCR
 
  笔者严格按照商业试剂盒的说明书进行操作。应用高纯度病毒RNA提取试剂盒(罗氏)从200μl的样本中提取病毒RNA。RNA用50μl洗脱缓冲液来洗脱用作RT–PCR模板。基于之前报道过的2019-nCoV S基因的检测方法来进行qPCR检测[5]。简单来说,以上提取的RNA由HiScript?II One Step qRT-PCR SYBR?Green 试剂盒来提取。20μl qPCR反应体系包含10μl 2×SYBRGreen Mix,1μl One Step SYBR Green Enzyme Mix,0.4μl 50×ROX Reference Dye 1,0.4μl(10μM)每对引物和2μl RNA模板。扩增过程如下:50℃持续3 min, 95℃持续30 s, 接着进行95℃持续10 s, 60℃持续30 s的40个循环,最后使用ABI 7500的PCR仪上默认的熔解曲线。
 
  血清学检测
 
  采用SARSr-CoV Rp3 NP作为抗原(据之前报道该抗原与所有SARSr-CoV具有90%以上的氨基酸同源性[5])笔者自主开发了内部应用的抗SARSr-CoV IgG和IgM ELISA的试剂盒。对于IgG检测,MaxiSorp Nunc-immuno 96 孔的 ELISA板用重组NP包被过夜(100 ng/孔)。将人血清1:20稀释置于37°下1小时进行检测。抗人IgG-HRP标记的单克隆抗体(Kyab生物技术股份有限公司,武汉,中国)按1:40000稀释加入。计算OD值(波长450-630)。对于IgM抗体的检测,MaxiSorp Nunc-immuno 96 孔ELISA板用抗人IgM(μ链)(500 ng /孔)包被过夜。将人血清1:100稀释后置于37°下40 min进行检测,最后加入稀释1:4000抗Rp3 NP-HRP偶联物(Kyab生物技术股份有限公司,武汉,中国)。计算OD值(波长450-630)
 
  结果
 
  第一部分研究中,为了测试肛门拭子和血液中是否如同口腔拭子一样可以检测到病毒阳性,笔者对收治于武汉肺科医院的2019-nCoV口腔拭子阳性患者进行了分子学研究,采集了血液、口腔拭子和肛门拭子样本进行2019-nCoV 的qPCR检测,方法如前所述[5]。
 
  在15名接受治疗数日仍携带病毒的患者中,8人口腔拭子阳性(53.3%),4人肛门拭子阳性(26.7%),6人血液阳性(40%),3人血清阳性(20%);2名患者同时存在口腔拭子和肛门拭子阳性,然而不存在血液和拭子同时阳性的患者。血清阳性的患者不出意外地均为血液阳性(见表1)。总之,即使口腔拭子中无法检测到病毒核苷酸的患者,仍可能存在肛门拭子或血液病毒核苷酸阳性。笔者应当注意的是,即使拭子病毒阴性,患者也有可能存在病毒血症。
 
  接着,笔者在另一组入院治疗10天的患者中连续观测口腔拭子和肛门拭子中病毒的动态变化情况,检测了病毒抗体和病毒核苷酸水平,方法如前所述[5]。结果显示,第0天(初次采集样本)IgM和IgG的滴度都相对较低或检测不到。第5天,几乎所有患者都出现了病毒抗体水平的升高,这通常被认为是早期感染向晚期感染的过渡(见图1和附表1)。IgM阳性率从50%(8/16)升高到81%(13/16),而IgG阳性从81%(13/16)升高到了100%(16/16),这与分子学检测(如下)的低阳性率相悖。
 
  分子学检测结果显示第0天16名患者中共有8人口腔拭子阳性(50%)和4人肛门拭子阳性(25%)。第5天,仅有4人口腔拭子阳性(25%),相反地,检测到6人肛门拭子阳性(37.5%)。合并所有拭子阳性结果分析,笔者发现第0天大多数拭子检测阳性来自于口腔拭子(8/10,80%)。然而,此趋势在第5天发生改变,肛门拭子阳性率(6/8,75%)高于口腔拭子阳性率(4/8,50%),同时笔者还发现6名第0天拭子检测阴性的患者再次出现了病毒。值得注意的是,这6名患者中4人为肛门拭子阳性(见表2)。这些数据提示了拭子检测存在着由早期较多口腔拭子阳性(由抗体滴度表明)向晚期较多肛门拭子阳性变化的情况。
 
  讨论
 
  在2019-nCoV病毒爆发后的1个月内,笔者迅速开发了分子和血清学检测工具。这是首次从7名确诊为不明病毒性肺炎的患者中初步鉴定为2019-nCoV后对该病毒进行的分子和血清学研究[5]。笔者在口腔拭子、肛门拭子和血液中都检测到该病毒,因此受感染的患者可能通过呼吸道、粪-口或体液途径传播该病原体。此外,笔者还成功地应用血清学方法对大量人群进行了检测,结果表明,该方法可以大大提高检测的阳性率。
 
  笔者发现,目前用于2019-nCoV诊断的口腔拭子中病毒RNA的检测策略并不完善。当口腔拭子检测阴性时,通过肛门拭子或血液学方法可以检测到该病毒。在SARS冠状病毒和MERS冠状病毒感染的患者中,观察到在感染后期这些患者存在肠道感染[7-9]。然而,感染2019-nCoV的患者在疾病的早期或晚期可能在肠道内藏有病毒。值得注意的是,病毒血症的患者血液标本均未检测出阳性。通过常规监测,这些患者可能被认为未感染2019-nCoV,从而对其他人构成威胁。相比之下,笔者几乎在所有患者血清中都发现了病毒抗体,表明流行病学应该考虑2019-nCoV的血清学。笔者可以观察到从早期感染时的口腔拭子阳性到晚期感染时的肛门拭子阳性的可能转变,这一观察结果表明,临床上不能仅仅基于口腔拭子阴性便允许患者出院,因为患者仍可能通过口-粪途径排出病毒。最重要的是,考虑到口腔拭子检测结果不可靠,笔者强烈建议使用病毒IgM 和IgG血清学试验来确认感染。
 
  综上所述,笔者在此提出警示:2019-nCoV可能通过多种途径传播,分子和血清学测试都是确定病毒感染所必需的。
 
  致谢
 
  感谢杜克-新加坡国立大学医学院Danielle Anderson教授对本文提出的批评和建议,感谢武汉病毒所国家病毒资源中心。
 
  /翻译:吉林大学第一医院  湛梦茹 任天羿 刘旭 李腊梅
 
  /编辑:临床肝胆病杂志  邢翔宇
 
  (来源:临床肝胆病杂志)

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